1、OrthoFinder 教程：用于比较基因组学的系统发育直系学推断

1.1 orthofinder介绍

OrthoFinder是一种快速、准确和全面的比较基因组学分析工具。它可以找到直系和正群，为所有的正群推断基因树，并为所分析的物种推断一个有根的物种树。OrthoFinder还为比较基因组分析提供全面的统计数据。OrthoFinder使用简单，只需运行一组FASTA格式的蛋白质序列文件(每个物种一个)。

1.2 Orthofinder安装

建议使用conda安装，简单方便，不用担心其他依赖和glibc版本的问题

1.创建一个工作目录。打开终端并运行以下命令：

<code>mkdir ~/orthofinder_tutorial

cd ~/orthofinder_tutorial

2.下载最新版本的 OrthoFinder（如果您使用 Bioconda，您仍需要执行此步骤来获取示例数据集）

wget https://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases/latest/download/OrthoFinder.tar.gz

如果你没有安装 wget，你可以试试 curl：

curl -L -O https://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases/latest/download/OrthoFinder.tar.gz

或者去GitHub发布页面下载OrthoFinder：https ://github.com/davidemms/OrthoFinder/releases

3.解压包，cd到OrthoFinder目录

tar xzvf OrthoFinder.tar.gz

cd OrthoFinder/

4.打印orthofinder帮助文件

orthofinder -h

5.在示例数据集上运行 OrthoFinder

orthofinder -f ExampleData/

你将会得到以下结果：

1.3 orhtofinder的使用示例

对一组模型生物进行系统基因组分析：小鼠、人类、青蛙、斑马鱼、日本河豚

在https://www.ensembl.org/，寻找相关基因^[2]

OrthoFinder 需要输入你感兴趣的物种中所有蛋白质编码基因的氨基酸序列。每个物种的序列应该在一个单独的文件中，文件扩展名为“.fa”、“.faa”、“.fasta”、“.fas”或“.pep”。当一个物种的基因组被测序并可用时，会执行两个主要步骤，即组装和注释。组装是将单个读数拼接到基因组序列中。注释是对基因组组装中感兴趣的特征的识别，例如蛋白质编码基因。因此，我们需要的文件通常位于名为“注释”的部分中。在 Ensembl 的右侧，在“基因注释”下单击“下载 FASTA”。如图：

单击“pep”文件夹（其中包含肽序列），然后将文件“Homo_sapiens.GRCh38.pep.all.fa.gz”下载到创建的文件夹中。

重复这一步骤下载其他物种序列信息，之后使用<code>gunzip *.gz解压相关文件。

为加快运行时间，使用orthofinder提供的python脚本，提取每个基因的最长的转录变体

for f in *fa ; do python ~/orthofinder_tutorial/OrthoFinder/tools/primary_transcript.py $f ; done

你将会得到primary_transcripts文件夹，之后运行

nohup orthofinder -f primary_transcripts/ &

运行时间比较长，你将会得到以下结果

一些重要概念^[1、3]

• Species-specific orthogroup: 一个仅来源于一个物种的直系同源组
• Single-copy orthogroup: 在直系同源组中，每个物种里面只有一个基因。我们会用单拷贝直系同源组里的基因推断物种树以及其他数据分析。
• Unassigned gene: 无法和其他基因进行聚类的基因。
• G50和O50，指的是当你直系同源组按照基因数从大到小进行排列，然后累加，当加入某个组后，累计基因数大于50%的总基因数，那么所需要的直系同源组的数目就是O50，该组的基因树就是G50.

Orthogroups, Orthologs 和 Paralogs 这三个概念推荐看图理解。

1.4 结果文件解读[3]

运行标准OrthoFinder会产生一系列文件：直系同源组、直系同源、基因树、物种树、基因复制事件、比较基因组学数据。结果文件在所分析物种的.fa文件目录下。

(1)Orthogroups 直系同源组目录^[2]

Orthogroups.tsv：用制表符分隔的文件，每一行包含属于单个直系同源组的基因。每个物种的直系同源组的基因单独排成一列。

Orthogroups.txt: 类似于Orthogroups.tsv，只不过是 OrthoMCL的输出格式。

Orthogroups_UnassignedGenes.tsv：用制表符分隔开的文件，格式上与Orthogroups.tsv相同，但包含的是未分配到任何直系同源组的基因。

Orthogroups_SingleCopyOrthologues.txt：每个物种正好包含一个基因的直系同源群列表，即它们包含一对一的直系同源物。 这种直系同源组非常适合进行种间比较和种树推断。

Orthogroups.GeneCount.tsv：格式同Orthogroups.tsv。每一行为一个直系同源组，每一列是每个物种每个直系同源组的基因数目。

（2）Orthologues 直系同源目录

在这个目录中，每个物种都有一个子目录。该子目录又包括每个物种对的比较文件。直系同源可以是一对一、一对多或多对多，这取决于基因复制事件。文件中的每一行都包含一个物种中的基因，而该基因是另一物种中该基因的直系同源物，并且每一行都被交叉引用到包含这些基因的直系同源组中。

（3）Comparative_Genomics_Statistics 比较基因组学数据目录^[2]

Statistics_Overall.tsv：用制表符分隔开的文件，其中包含有直系同源组分析的常规统计信息。（总体统计信息）

Statistics_PerSpecies.tsv：用制表符分隔开的文件，内容与Statistics_Overall.tsv相似，但分物种。（分物种统计信息）

Duplications_per_Orthogroup.tsv：制表符分隔开的文件，该文件给出每个直系同源组中标识的复制项的数量。

Duplications_per_Species_Tree_Node.tsv：制表符分隔开的文件，该文件给出了沿物种树的每个分支发生的复制次数。

Orthogroups_SpeciesOverlaps.tsv：制表符分隔开的文件，包含每个物种对共享的直系同源群数目。

OrthologuesStats_？-to-？.tsv:制表符分隔开的文件,包含矩阵。这些矩阵给出了每对物种之间一对一，一对多和多对多关系的直系同源物数量。

（4）Gene_Duplication_Events 基因复制事件目录

Duplications.tsv：制表符分隔的文件，其中列出了所有基因复制事件，这些事件是通过检查每个直系同源群基因树的每个节点来标识的。

SpeciesTree_Gene_Duplications_0.5_Support.txt：提供了物种树分支上上述复制的总和。 它是newick格式的文本文件。 每个节点/物种名称后面的数字是在导致节点/物种的分支上发生的具有至少50％支持的基因复制事件的数量。

（5）Gene_Trees 基因树目录

为每个直系同源群推断的系统发育树。

（6）Orthogroup_Sequences 直系同源组序列目录

每个直系同源群的FASTA文件,给出了每个直系同源群中每个基因的氨基酸序列。

（7）Resolved_Gene_Trees 解析的基因树目录

为每个直系同源组推断出有根的系统发育树，使用OrthoFinder复制损失合并模型进行解析。

（8）Single_Copy_Orthologue_Sequences 单拷贝直系同源组序列目录

与直系同源组序列目录相似的文件。每个物种一对一的直系同源组。

（9）Species_Tree 物种树目录

SpeciesTree_rooted.txt：从所有直系同源组推断出的STAG物种树，包含内部节点上的STAG支持值，并以STRIDE(Species Tree Root Inference from Duplication Events)为根。STAG(Species Tree from All Genes)是一种从所有基因推测物种树的算法，不同于使用单拷贝的直系同源基因进行进化树构建。

SpeciesTree_rooted_node_labels.csv：同上，但是节点具有标签，以允许其他结果文件交叉引用物种树中的分支/节点（例如基因复制事件的位置）。

本节参考文献：

1. 「基因组学」使用OrthoFinder进行直系同源基因分析
2. OrthoFinder-用于比较基因组学的系统发育直系学推断
3. orthofinder结果解读

2.系统发育树的构建

利用orthofinder寻找单拷贝基因构建系统发育树